Dosage des composés phénoliques dans la fumée principale de tabac

Santé Canada
T-114 31 décembre 1999

Table des matières

1. Portée
2. Normes applicables
3. Définitions
4. Résumé de la méthode
5. Appareillage et équipement
6. Réactifs et matériel
7. Préparation de la verrerie
8. Préparation des solutions
9. Préparation des étalons
10. Échantillonnage
11. Préparation des produits du tabac
12. Préparation de la machine à fumer
13. Production des échantillons
14. Analyse des échantillons
15. Contrôle de la qualité
16. Modifications pour des conditions intenses de fumage
17. Références
18. Annexes

1 Portée

1. Cette méthode décrit l'extraction et le dosage par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en phase inversée des composés phénoliques contenus dans la matière particulaire totale (MPT) de la fumée principale de tabac.
2. La présente méthode s'applique au piégeage sur un disque filtrant en fibre de verre (tampon) et au dosage des composés phénoliques dans la fumée principale de tabac.

2 Normes applicables

1. American Society for Testing and Materials (ASTM) : Méthode D 1193-77 Standard Specifications for Reagent Water, Version 1977.
2. Méthode d'essai T-115 de Santé Canada - Dosage du goudron, de l'eau, de la nicotine et du monoxyde de carbone dans la fumée principale de tabac, 1999-12-31.

3 Définitions

1. Pour une définition des termes utilisés dans le présent document, se reporter à la méthode T-115.

4 Résumé de la méthode

1. Cinq cigarettes* sont fumées sur chaque canal d'une machine à fumer linéaire à 20 canaux.
   *Pour d'autres produits du tabac, retenir un nombre tel que le filtre ne soit pas saturé.
2. La matière particulaire totale (MPT) de la fumée principale de tabac est piégée sur des tampons, puis extraite avec 40 mL d'acide acétique à 1 %.
3. Une portion de l'extrait de MPT est ensuite filtrée avec une seringue-filtre, diluée, puis analysée par chromatographie liquide à gradient en phase inversée.
4. Les phénols sont détectés avec un détecteur de fluorescence et dosés par comparaison avec un étalonnage externe.
   
   Nota : L'analyse et l'évaluation de certains produits à l'aide de cette méthode peuvent nécessiter l'utilisation de substances ou d'équipement potentiellement dangereux. Le présent document n'entend pas répondre à tous les aspects concernant la sécurité de son utilisation. Avant d'utiliser cette méthode normalisée, toute personne a la responsabilité de consulter les autorités compétentes et de prendre des mesures de protection de la santé et des mesures de sécurité qui tiennent compte des règlements en vigueur.

5 Appareillage et équipement

1. Équipement nécessaire au conditionnement, tel que défini dans la méthode T- 115.
2. Équipement nécessaire au marquage de la longueur des mégots, tel que défini dans la méthode T-115.
3. Équipement nécessaire au fumage mécanique des produits du tabac, tel que défini dans la méthode T-115.
4. Balance analytique donnant au moins quatre places décimales.
5. Agitateur oscillant.
6. Étuve pour le séchage de la verrerie.
7. Brucelles et gants pour le transfert des tampons.
8. Erlenmeyers de 150 mL avec bouchons en verre rodé.
9. Système de chromatographie liquide haute performance (CLHP) piloté par un ordinateur personnel, comprenant :
   1. Système d'alimentation en solvant - pompe à gradient ternaire.
   2. Échantillonneur automatique réfrigéré, muni d'une boucle d'échantillonnage de 20 µL .
   3. Spectrofluorimètre.
   4. Modificateur de température de colonne.
   5. Bain de refroidissement.
   6. Poste de travail.
10. Colonne RP 18e pour CLHP, 5 µm, 250 × 4 mm.
11. Colonne de garde jetable, 10 × 4 mm.
12. Fioles jaugées de 10, 25 et 50 mL, rouge actinique.
13. Micropipettes en verre, de divers volumes, 100, 150, 300, 400, 500, 800, 1000 et 2000 µL.
14. Pipettes en verre, de 1, 2, 5, 6, 7, 8 et 20 mL.
15. Erlenmeyers en verre avec rodage conique, 50 mL, rouge actinique.
16. Éprouvettes graduées de 25 et 50 mL.

6 Réactifs et matériel

Nota : Tous les réactifs doivent être, au minimum, des réactifs de qualité analytique.

1. Seringue-filtre de 0,45 µm, en PVDF.
2. Seringues jetables.
3. Pipettes Pasteur jetables, en verre.
4. Gants jetables.
5. Poires en caoutchouc.
6. Flacons pour échantillonneur automatique, avec bouchons à vis et septums.
7. Ruban masque.
8. Méthanol, distillé dans du verre.
9. Acétonitrile, distillé dans du verre.
10. Isopropanol, distillé dans du verre.
11. Acide acétique, qualité CLHP.
12. Eau de type I, satisfaisant à la norme D 1193 de l'ASTM.
13. Hydroquinone, pureté > 99 %.
14. Résorcinol, pureté > 99 %.
15. Catéchol, pureté > 99 %.
16. Phénol, pureté > 99 %.
17. m-Crésol, pureté > 99 %.
18. p-Crésol, pureté > 99 %.
19. o-Crésol, pureté > 99 %.

7 Préparation de la verrerie

1. Le lavage et le séchage de la verrerie doivent être effectués de manière à ce que celle-ci ne cause pas de contamination.

8 Préparation des solutions

1. Préparer 4 L de solution d'acide acétique à 1 % dans de l'eau de type I (40 mL d'HOAc dilué à 4 L) et vérifier l'absence de contamination par CLHP.

9 Préparation des étalons

1. Étalons primaires de phénols (voir annexe 1)
   1. Peser environ 25 mg de chacun des phénols suivants (Hydroquinone, résorcinol, catéchol, phénol, m-crésol, p-crésol et o-crésol) dans des fioles jaugées de 25 mL et compléter avec la solution à 1 % d'acide acétique.
   2. Les concentrations seront d'environ 1,0 mg/mL. Préparer de nouveaux étalons primaires de phénols tous les 10 jours.
2. Étalons secondaires de phénols (voir annexe 1)
   1. Prélever des volumes appropriés des étalons primaires de phénols et diluer jusqu'à 10 mL avec de l'acide acétique à 1 %.
   2. Préparer de nouveaux étalons secondaires de phénols chaque fois que de nouveaux étalons primaires sont préparés.
3. Solution tertiaire de phénols (voir annexe 1)
   1. Prélever des volumes correspondants de chacune des solutions de phénols et les mettre dans une seule fiole jaugée de 50 mL. Compléter avec de l'acide acétique à 1 %.
   2. Préparer une nouvelle solution tertiaire de phénols tous les cinq jours.
4. Étalons de travail
   1. Prélever des volumes appropriés (de 0,100 à 7,5 mL) de solution tertiaire de phénols et diluer jusqu'à 10 mL avec de l'acide acétique à 1 % (voir l'annexe 1).
   2. Transférer dans des flacons pour échantillonneur automatique.
   3. Préparer de nouveaux étalons de travail tous les cinq jours.
5. Solution de dopage
   1. Ajouter des volumes appropriés de solutions étalons de phénol (voir annexe 1) dans une fiole jaugée de 50 mL et compléter avec de l'acide acétique à 1 %.
   2. Préparer une nouvelle solution de dopage tous les cinq jours ouvrables.

10 Échantillonnage

1. L'échantillonnage des produits du tabac à analyser doit être effectué conformément à la méthode T-115.

11 Préparation des produits du tabac

1. Le conditionnement du produit doit être effectué conformément à la méthode T-115.
2. La longueur de mégot des cigarettes, des équivalents-cigarettes, des bidis, des kreteks et des cigares doit être indiquée conformément à la méthode T-115.
3. La préparation des cigarettes à être fumées dans des conditions intenses doit être effectuée conformément à la méthode T-115.

12 Préparation de la machine à fumer

1. Conditions ambiantes
   1. Les conditions ambiantes de fumage doivent être conformes à celles de la méthode T-115.
2. Conditions relatives à la machine à fumer
   1. Les conditions relatives à la machine à fumer doivent être conformes à celles de la méthode T-115.

13 Production des échantillons

1. La MPT de la fumée principale de tabac provenant de cinq cigarettes est piégée sur un tampon, dans les conditions définies dans la méthode T-115.
2. Après avoir fumé cinq cigarettes sur chaque canal :
   1. Tirer trois bouffées de garde supplémentaires.
   2. Consiogner le poids du porte-filtre et du tampon après le fumage afin de déterminer la MPT.

14 Analyse des échantillons

1. Extraction des tampons
   1. Une série d'analyses comprend 20 échantillons (tampons). Traiter 20 échantillons à la fois. Ne pas traiter plus d'échantillons que le nombre pouvant être analysé en 24 heures. La température et le délai d'analyse sont particulièrement importants dans le cas de l'hydroquinone.
   2. Retirer le tampon du porte-filtre, le plier en quatre et essuyer l'intérieur du porte-filtre avec le côté propre du tampon. En utilisant des brucelles propres, insérer le tampon dans un erlenmeyer rouge actinique de 50 mL, convenablement étiqueté.
   3. Ajouter 40 mL d'acide acétique à 1 % dans l'erlenmeyer contenant le tampon, boucher le flacon, puis mettre un morceau de ruban masque de 1 po sur le bouchon en verre rodé pour le maintenir en place.
   4. Pour s'assurer que le système d'analyse, la verrerie et les réactifs ne causent pas de perturbations, analyser un blanc de réactifs (BR) et un blanc fortifié (BF) avec chaque série d'analyses.
      BR : Mettre un tampon conditionné et non utilisé dans un erlenmeyer, ajouter 40 mL d'acide acétique à 1 % et boucher.
      BF : Mettre un tampon conditionné et non utilisé dans un erlenmeyer, ajouter 39 mL d'acide acétique à 1 % et 1 mL de solution de dopage, puis boucher.
   5. Mettre ensuite les erlenmeyers sur un agitateur oscillant et agiter pendant 30 minutes (le tampon se désintégrera).
   6. Après agitation, diluer les extraits de MPT à l'acide acétique dans des fioles jaugées de 10 mL avec de l'acide acétique à 1 %, selon le tableau suivant.
      
      Le tableau suivant présente des renseignements sur la MPT par tampon, le volume de l’extrait de fumée et le volume final requis pour atteindre une dilution donnée selon le type de cigarette : légère, régulière ou forte.
      
      

      Type de cigarette	MPT par tampon (mg)	Volume de l'extrait (mL)	Volume final (mL)
      Légère	5 -15	0	Pas de dilution
      Régulière	15 - 60	4	10
      Fort	60 - 100	2	10

      
      *Marques de cigarettes « Ultra légères » - Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue jetable de 5 cm3 et filtrer l'extrait directement dans deux flacons de pour échantillonneur automatique. Jeter les 10 premières gouttes, mettre quelques gouttes dans les flacons pour les rincer, puis jeter le liquide de rinçage. Remplir ensuite les flacons en réduisant au minimum l'espace de tête.
      
      *Marques de cigarettes « Ordinaires » et « Pleine saveur » - Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue jetable de 5 cm³ et filtrer l'extrait directement dans une fiole jaugée de 10 mL contenant 7 mL d'acide acétique à 1 % ou assez de solution pour diluer l'extrait à 10 mL. Bien mélanger le contenu de la fiole jaugée et, avec une pipette Pasteur, remplir deux flacons pour échantillonneur automatique. Rincer d'abord les flacons, puis les remplir en réduisant au minimum l'espace de tête.
   7. À l'aide d'une seringue, filtrer directement les BR et les BF dans des flacons pour échantillonneur automatique.
      1. Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue jetable de 5 cm³ et filtrer l'extrait du tampon du blanc directement dans deux flacons pour échantillonneur automatique. Jeter les 10 premières gouttes, mettre quelques gouttes dans les flacons pour rincer, jeter le liquide de rinçage, puis remplir en réduisant au minimum l'espace de tête.
   8. Avec chaque série d'analyses, préparer une matrice fortifiée (MF) en utilisant une marque de cigarette témoin.
      
      Le tableau suivant présente la matrice fortifiée de laboratoire préparée avec une marque de cigarette témoin pour chaque série d’analyses d’échantillons de fumée.
      
      

      Réactif	Échantillon	MF
      Solution de dopage au phénol	0	1
      Extrait	3	3
      Acide acétique à 1 % (mL)	7	6
      Volume total (mL)	10	10

      
      Échantillons de MF - Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue jetable de 5 cm3 et filtrer l'extrait directement dans une fiole jaugée de 10 mL contenant 5 mL d'acide acétique à 1 % et 1 mL de solution de dopage au phénol.
   9. Bien mélanger le contenu de la fiole jaugée et, à l'aide d'une pipette Pasteur, remplir deux flacons pour échantillonneur automatique. Rincer d'abord les flacons, puis les remplir en réduisant au minimum l'espace de tête.
   10. Placer les flacons dans un porte-flacons et les entreposer au réfrigérateur à 4 °C, à l'abri de la lumière, jusqu'au moment de leur analyse.
   11. Un registre est alors créé afin de noter le temps total pendant lequel les échantillons restent à la température ambiante, depuis le fumage jusqu'à leur analyse.
       
       Nota : Il est très important de traiter les échantillons le plus rapidement possible, sans interruption, car ils se décomposent s'ils restent exposés longtemps à la température ambiante.
2. Analyse : Équipement de CLHP
   1. Système de chromatographie liquide à haute pression comprenant :
      Système d'alimentation en solvant - pompe ternaire à gradient
      Échantillonneur automatique réfrigéré, muni d'une boucle d'échantillonnage de 20 µL
      Spectrofluorimètre à longueur d'onde programmable, réglé à un gain de 100 et à une atténuation de 8
      Largeur de fente : Excitation, 18 nm; émission, 18 nm
   2. Programmation des longueurs d'onde :
      
      Le tableau suivant présente les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à plusieurs points dans le temps.
      
      

      Temps	Excitation (nm)	Émission (nm)
      0.0	304	338
      5.5	274	298
      32.0	274	298
      33.0	304	338

   3. Bain de refroidissement avec système de thermorégulation de la colonne.
   4. Poste de travail.
3. Conditions chromatographiques (analyse en phase inversée)
   1. Température de la colonne : 20 °C.
   2. Phase mobile : réactifs.
      Solvant A : Préparer 2 litres d'une solution contenant 1 % d'acétonitrile, 1 % d'acide acétique et 1 % d'isopropanol, filtrer et dégazer (par barbotage d'hélium ultra-pur).
      Solvant B : Préparer 2 litres d'une solution contenant 28 % d'acétonitrile, 1 % d'acide acétique et 1 % d'isopropanol, filtrer et dégazer (par barbotage d'hélium ultra-pur).
      Solvant C : Acétonitrile (dégazé par barbotage d'hélium ultra-pur).
   3. Lavage de l'échantillon : Solvant A
   4. Phase mobile : Gradient
      
      Le tableau suivant présente le pourcentage des solvants dans la phase mobile destinée à l’élution par gradient à plusieurs points dans le temps (de 0 à 34 minutes), en vue de la séparation des analytes durant la chromatographie liquide haute performance.
      
      

      Débit Temps (min)	1,5 mL/min Composition
      	% A	% B	% C
      0.0	100	0	0
      5.0	100	0	0
      15.0	75	25	0
      20.0	25	75	0
      28.0	0	100	0
      30.0	0	0	100
      32.0	0	0	100
      34.0	95	0	5
      Fin de l'analyse	100	0	0
      (équilibrer pendant 10 min)

   5. Charger dans l'échantillonneur automatique les flacons contenant les échantillons, de manière à ce qu'il y ait un étalon à tous les 10 échantillons; de plus, la somme des temps de préparation des échantillons et des temps en file d'attente à la température ambiante ne doit pas dépasser 24 heures.
   6. Injecter 20 µL de chaque échantillon sur la colonne pour CLHP. Les chromatogrammes d'élution devraient ressembler à celui de la figure 2.
4. Calculs
   1. Préparation d'une courbe d'étalonnage
      1. Injecter 20 µL de chaque solution d'étalonnage sur la colonne de CLHP et les analyser. Effectuer l'analyse en double. Les chromatogrammes d'élution devraient ressembler à celui de la figure 1.
      2. Préparer une courbe d'étalonnage pour les différents hydroxybenzènes en traçant la surface des pics en fonction de la concentration.
      3. Calculer le facteur de réponse.
   2. Dosage des échantillons
      1. Doser les différents composés phénoliques présents dans les échantillons par la méthode de l'étalon externe.
      2. Identifier les pics par comparaison des temps de rétention obtenus avec les étalons et par dopage des échantillons de fumée.
   3. Détermination des teneurs en phénol [µg/cigarette]
      Hydroxybenzène [µg/cigarette] = [Surface du pic/ Facteur de réponse] × [FD / Nbre de cigarettes]
      dans laquelle, FD est le facteur de dilution.

15 Contrôle de la qualité

1. Chromatogramme typique
   1. Voir figure 1 et figure 2.
2. Taux de récupération et niveaux de contamination
   1. Chaque série d'analyses doit aussi comprendre :
      1. Un blanc de réactif (BR) pour évaluer l'importance des perturbations dues à la verrerie, aux réactifs de piégeage, aux tampons et aux effets du système d'analyse.
      2. Un blanc fortifié (BF) pour évaluer l'importance des pertes possibles d'analytes.
      3. Une matrice fortifiée (MF) pour évaluer les perturbations dues à la matrice. Pour ce faire, on dope un échantillon véritable avec une quantité connue, puis on détermine le taux de récupération.
3. Limite de détection de la méthode (LDM) et limite de dosage (LDD)
   1. Limite de détection de la méthode (LDM)
      Déterminer la limite de détection de la méthode en analysant l’étalon le moins concentré, comme s’il s’agissait d’un échantillon, au moins 10 fois sur une période de plusieurs jours. La LDM est égale à trois fois l’écarttype de ces résultats.
   2. Limite de dosage (LDD)
      Déterminer la limite de dosage en analysant l'étalon le moins concentré, comme s'il s'agissait d'un échantillon, au moins 10 fois sur une période de plusieurs jours. La LDD est égale à 10 fois l'écart-type de ces résultats.
4. Stabilité des réactifs et des solutions
   1. Préparer de nouveaux étalons primaires de phénols chaque semaine.
   2. Préparer de nouveaux étalons de travail et de nouveaux réactifs chaque semaine.
   3. Analyser tous les échantillons dès que possible après le fumage et dans les 24 heures.

16 Modifications pour le fumage dans des conditions intenses

1. Dans des conditions intenses de fumage, fumer deux cigarettes.

17 Références

1. Risner, C.H. et Cash, S.L. A High Performance Liquid Chromatographic Determination of Major Phenolic Compounds in Tobacco Smoke, Journal of Chromatographic Science, 28, 1990.

Annexes

Annexe 1 : Étalons de phénol

Ce tableau présente les étalons de phénol pour plusieurs analytes. Il indique le poids, la pureté et le volume des étalons primaires; ainsi que le volume, le volume final et la concentration des étalons secondaires et tertiaires. Les analytes de phénol sont : hydroquinone, résorcinol, catéchol, phénol, m-crésol, p-crésol, o-crésol, et m+p-crésol.

* dans de l'acide acétique à 1 % (v/v)
** dans de l'acide acétique à 1 % (v/v), dans une seule fiole jaugée de 50 mL

Ce tableau présente les concentrations des étalons de travail de plusieurs analytes de phénol, à savoir : hydroquinone, résorcinol, catéchol, phénol, m-crésol, o-crésol, et m+p-crésol.

+ dans de l'acide acétique à 1 % (v/v), dans des fioles jaugées individuelles de 10 mL

Ce tableau présente des renseignements sur la dilution des solutions mères primaires et secondaires utilisées pour préparer les solutions de dopage. Des solutions mères primaires d’hydroquinone et de phénol et une solution mère secondaire d’o-crésol ont été utilisées pour préparer les solutions de dopage.

*** dans de l'acide acétique à 1 % (v/v), dans une seule fiole jaugée de 25 mL
++ dans de l'acide acétique à 1 % (v/v), dans une seule fiole jaugée de 10 mL

Figure 1 : Chromatogramme d'un étalon typique de phénols

Cette figure est un chromatogramme d’un étalon de phénol typique.

Figure 2 : Analyse chromatographique des phénols présents dans la MPT de la fumée principale de tabac

Cette figure présente une analyse chromatographique des phénols présents dans la MPT de la fumée principale de tabac.