Essai de mutation réverse chez des bactéries avec de la fumée principale de tabac

Santé Canada
T-501 Deuxième édition
01 novembre 2004

Table des matières

1. Portée
2. Normes applicables
3. Définitions et abréviations
4. Résumé de la méthode
5. Appareillage et équipement
6. Réactifs et matériel
7. Préparation de la verrerie et du matériel en plastique
8. Préparation des solutions et des milieux
9. Souches d’essai
10. Collecte de la MPT
11. Traitement de la MPT
12. Essai de mutagénicité
13. Contrôle de la qualité et données à consigner
14. Analyse statistique et interprétation des résultats
15. Communication des résultats de l’essai
    
16. Références
17. Annexes

1 Portée

1. Ce document explique comment réaliser un essai de mutation réverse chez des bactéries (« test d’Ames ») avec préincubation, à partir de la matière particulaire totale (MPT) de la fumée principale de tabac.

2 Normes applicables

1. Organisation de coopération et de développement économiques. Lignes directrices pour les essais de produits chimiques, OCDE n° 471 : Essai de mutation réverse sur des bactéries. 21 juillet 1997.
2. Méthode officielle T-115 de Santé Canada. Dosage du goudron, de la nicotine et du monoxyde de carbone dans la fumée principale de tabac. Deuxième édition. 2003. (Dispositions relatives aux cigarettes fabriquées seulement).
3. Méthode officielle T-304 de Santé Canada. Dosage des humectants dans le tabac entier. Deuxième édition. 2003.
4. Organisation internationale de normalisation. Norme ISO 4387 : Cigarettes - Détermination de la matière totale et de la matière anhydre et exempte de nicotine au moyen d'une machine à fumer analytique de routine. Troisième édition. 2000.
5. Maron, D.M. et Ames, B.N. Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Research, 113:173-215, 1983.
6. Mortelmans, K. et Zeiger, E. The Ames Salmonella/Microsome Mutagenicity Assay. Mutation Research, 455: 29-60, 2000.

3 Définitions et abréviations

1. Cofacteur : Substance organique non protéique qui doit être liée à une enzyme pour que celle-ci agisse.
2. Disque filtrant (tampon) en fibre de verre : Tampon utilisé pour recueillir la matière particulaire de la fumée de tabac.
3. DMSO : Diméthylsulfoxyde.
4. Facteur R : Plasmide contenant les gènes MucA/B, qui peuvent provoquer des dommages, ainsi qu’un gène de résistance aux antibiotiques. Les gènes MucA/B accroissent la susceptibilité de Salmonella aux agents pouvant causer des dommages à l’ADN.
5. Fraction hépatique de rat S9 : Surnageant d’homogénats de cellules hépatiques obtenues de rats mâles exposés à une substance stimulant l’activité enzymatique (telle que l’Aroclor-1254, le phénobarbitone ou le ß-naphthoflavone). Cette fraction permet de simuler in vitro les réactions d’activation métabolique qui ne se produisent généralement que dans le foie des mammifères.
6. Histidine (his) : Acide aminé essentiel nécessaire à la croissance de la bactérie Salmonella dans cet essai.
7. Matière particulaire totale : Partie de la fumée principale qui est piégée par le disque filtrant (tampon) en fibre de verre.
8. Mélange S9 : Mélange de la fraction hépatique de rat S9 et d’autres cofacteurs qui forment le système d’activation métabolique dans le présent essai.
9. Mutagène : Substance qui provoque des changements permanents dans la séquence de codage de l’ADN ou dans la structure chromosomique.
10. Mutant : Organisme qui diffère de la souche parentale en raison d’une mutation.
11. Mutation : Modification d’un gène ou d’un chromosome par rapport au type sauvage.
12. Mutation rfa : Mutation qui augmente la perméabilité de la paroi bactérienne aux grosses molécules.
13. Mutation spontanée : Mutation qui n’est pas causée par l’ajout de la substance à tester ni du témoin.
14. Mutation uvrB : Mutation donnant une bactérie qui est anormalement sensible à une variété d’agents physiques et chimiques pouvant causer des dommages à l’ADN, y compris les rayons utlraviolets.
15. Procédure d’asepsie : Ensemble des mesures visant à empêcher la contamination microbienne des cultures, des instruments, des milieux et des échantillons.
16. Révertant : Bactérie de type sauvage qui était auparavant un mutant auxotrophe.
17. 3.17 Souche d’essai de Salmonella typhimurium : La bactérie Salmonella typhimurium modifiée génétiquement utilisée dans le présent essai.
18. Sous-échantillon : Mélange de MPT préparé à partir d’un groupe de cigarettes fumées en même temps, provenant du même échantillon de cigarettes.
19. Substitution de paires de bases : Substitution d’une paire de bases azotées par une autre dans une séquence d’ADN.
20. Test avec préincubation : Test d’Ames modifié dans lequel le mélange des souches bactériennes, du composé à l’essai et du mélange d’activation métabolique S9 ou du tampon phosphate est incubé à 37 oC durant 20 minutes avant d’être ajouté à la gélose de surface et d’être étalé sur des plaques de gélose minimale au glucose.
21. Test d’Ames : Essai de mutagénicité bactérienne également appelé « essai de mutation réverse de bactéries », « test de mutagénicité sur Salmonella », « test de mutagénicité sur Salmonella  avec microsomes de mammifères » et « test de mutation réverse sur Salmonella typhimurium ». Le test de détection des réversions histidine (his) chez Salmonella typhimurium est un essai microbiologique qui permet de détecter la mutation d’un gène chez un mutant auxotrophe pour l’histidine par suite de la substitution de paires de bases ou de changements du cadre de lecture dans la séquence d’ADN de la bactérie Salmonella typhimurium, ce qui produit une souche de type sauvage.

4 Résumé de la méthode

1. La fumée principale de cigarettes (p. ex. 20 cigarettes) fumées sur une machine à fumer rotative selon les conditions ISO modifiées (intenses), est piégée par un disque filtrant (tampon) en fibre de verre de 44 ou 92 mm de diamètre, conformément à l’annexe 1. (V. note à l’annexe au sujet des dimensions du disque filtrant.) Le nombre de sous-échantillons doit être conforme à la réglementation applicable.
2. La matière particulaire totale (MPT) piégée par un tampon est extraite au DMSO (diméthylsulfoxyde) jusqu’à une concentration cible de 10 mg de MPT par mL de DMSO, conformément à l’annexe 2.
3. Les échantillons de MPT font l’objet d’une caractérisation plus poussée (eau, nicotine, goudron, glycérol, menthol et 1,2-propylèneglycol, s’il y a lieu), conformément l’annexe 3.
4. Dans la méthode avec préincubation mise au point par Yahagi et ses collaborateurs (1975), une souche mutante de Salmonella typhimurium histidine-dépendante (his-) est mélangée à un produit chimique (en l’occurrence le mélange de MPT) en présence ou en l’absence d’enzymes de foie de rat (mélange S9). On ajoute de la gélose molle fondue (couche de surface) au mélange, qui est ensuite étalé sur une gélose minimale au glucose. Après la solidification de la gélose, la plaque est incubée à 37 ± 1 °C durant 48 à 72 heures.
   
   Nota : Avec le test d’Ames modifié avec préincubation, on observe une sensibilité accrue à certains produits chimiques par rapport à la méthode d’incorporation dans la plaque.
5. Les colonies, qui sont formées de révertants de type sauvage n’ayant pas besoin d’histidine pour croître (his+), sont ensuite comptées.
6. Le nombre de sous-échantillons doit être conforme à la réglementation applicable.

Mise en garde : L’analyse et l’évaluation de certains produits à l’aide de cette méthode d’essai peuvent exiger l’utilisation de matériel et/ou d’équipement potentiellement dangereux. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les aspects de sécurité liés à l’utilisation de ce test. Il incombe à l’utilisateur de consulter les autorités compétentes et de déterminer au préalable les pratiques adéquates de santé et sécurité, conformément aux exigences réglementaires applicables.

5 Appareillage et équipement

1. Équipement nécessaire pour recueillir la MPT conformément à l’annexe 1.
2. Équipement nécessaire pour préparer la MPT conformément à l’annexe 2.
3. Équipement nécessaire pour procéder à une caractérisation plus poussée de la MPT conformément à l’annexe 3.
4. Tout l’appareillage et l’équipement nécessaires pour effectuer le test d’Ames. Voir Maron et Ames (1983) et Mortelmans et Zeiger (2000) pour plus de détails.

6 Réactifs et matériel

Nota : Tous les réactifs doivent être exempts de mutagènes ou, à tout le moins, ne pas augmenter le taux de mutation spontanée. Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de qualité analytique.

1. Pour connaître les produits chimiques nécessaires, voir Maron et Ames (1983) et Mortelmans et Zeiger (2000).
2. Souches d’essai de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537.
3. Réactifs et matériel nécessaires pour recueillir la MPT conformément à l’annexe 1.
4. Réactifs et matériel nécessaires pour préparer la MPT conformément à l’annexe 2.
5. Réactifs et matériel nécessaires pour procéder à une caractérisation plus poussée de la MPT conformément à l’annexe 3.

7 Préparation de la verrerie et du matériel en plastique

1. Nettoyer et stériliser la verrerie et le matériel en plastique.
2. Nettoyage requis pour recueillir la MPT conformément à l’annexe 1.
3. Nettoyage requis pour préparer la MPT conformément à l’annexe 2.
4. Nettoyage requis pour procéder à une caractérisation plus poussée de la MPT conformément à l’annexe 3.

8 Préparation des solutions et des milieux

1. Préparer les cancérogènes potentiels sous une hotte en prenant les précautions nécessaires pour ce type de produit dangereux.
2. Voir Maron et Ames (1983) pour en savoir plus sur la préparation des solutions et des milieux nécessaires à l’essai.
3. Préparer les solutions témoins positives nécessaires à l’analyse. Un exemple est présenté dans l’article de Mortelmans et Zeiger (2000).
4. Voir l’annexe 3 pour connaître les solutions requises pour une caractérisation plus poussée de la MPT.

9 Souches d’essai

1. Cultures de souches bactériennes d’essai
   1. Obtenir les souches d’essai suivantes de Salmonella typhimurium : TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537.
2. Préparation des cultures de souches d’essai
   1. Consulter l’article de Mortelmans et Zeiger (2000) pour connaître les méthodes de préparation, de conservation, d’analyse, de purification et de contrôle de la qualité des cultures de souches d’essai.
   2. Voir Maron et Ames (1983) pour connaître la méthode de confirmation du génotype des souches d’essai en ce qui concerne les éléments suivants :
      • Besoin d’histidine
      • Mutation rfa
      • Mutation uvrB
      • Présence du facteur R (résistance à l’ampicilline et à l’association ampicilline-tétracycline)

10 Collecte de la MPT

1. Voir l’annexe 1 : Collecte de la MPT sur disque filtrant en fibre de verre.

11 Traitement de la MPT

1. Voir l’annexe 2 : Préparation de la MPT à partir du disque filtrant en fibre de verre.
2. Les échantillons de MPT font l’objet d’une caractérisation plus poussée conformément à l’annexe 3.

12 Essai de mutagénicité

1. Respecter les procédures d’asepsie standard pour les analyses microbiologiques.
2. Préparation d’une culture bactérienne fraîche d’une nuit pour l’essai de mutagénicité
   1. Préparer la culture de la souche d’essai à une densité de 1 à 2 x 109 bactéries par mL tel qu’indiqué par Maron et Ames (1983).
   2. La densité bactérienne de la culture utilisée doit être estimée par la mesure de la densité optique à 650 nm et la numération des bactéries viables.
   3. Confirmer la densité de la culture de la souche d’essai en comptant le nombre de bactéries viables comme suit :
      • Effectuer des dilutions en série en mélangeant la quantité appropriée de culture bactérienne (p. ex. 100 µL de) et de bouillon nutritif (p. ex. 900 µL) et ensemencer la dilution appropriée sur des plaques de gélose nutritive.
      • Incuber les plaques à 37 ± 1 °C et, après 24 heures, compter le nombre de colonies manuellement ou à l’aide d’un dispositif de comptage automatisé approprié.
   4. Garder la ou les cultures à la température ambiante (c.-à-d. 22 ± 2 oC) durant l’essai.
3. Essai (méthode avec préincubation) :
   1. Pour préparer l’essai, faire ce qui suit le jour de l’essai :
      
      • Préparer le mélange S9 à 5 %, selon l’ordre indiqué :
        

        Ingrédients	(pour 50 mL)
        Eau stérile désionisée	19,25 mL
        Solution tampon phosphate 0,2M, pH 7,4	25,00 mL
        Solution 0,1M Nicotine Adénine Dinucléotide Phosphate (NADP)	2,00 mL
        Solution 1M Glucose-6-Phosphate	0,25 mL
        Solution 0,4M chlorure de magnésium (MgCl2)+1,65M chlorure de potassium (KCl)	1,00 mL
        Fraction hépatique de rat S9	2,50 mL

      • Préparer la gélose de surface selon la méthode de Maron et Ames (1983).
      • Retirer les échantillons du congélateur cryogénique (-70 oC ou moins) et les décongeler à la température ambiante.
      • Sortir les témoins nécessaires de l’endroit où ils sont conservés (congélateur ou réfrigérateur) et les laisser atteindre la température ambiante.
      • Étiqueter tous les tubes et plaques requis pour les échantillons et les témoins de l’essai.
   2. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à essai stérile préalablement étiqueté en ajoutant la quantité appropriée de tampon phosphate ou de mélange S9, la quantité appropriée de solvant, d’échantillon de MPT ou de solution témoin positive ainsi que la culture bactérienne fraîchement préparée. Consulter la ligne directrice No 471 de l’OCDE (1997) pour de plus amples détails.
      
      Nota : Le protocole de dosage doit comprendre au moins une concentration qui se situe dans l’intervalle de toxicité. Au moins sept (7) concentrations non nulles doivent être utilisées. On ne peut déterminer à l’avance les concentrations à utiliser, car elles dépendent de la nature de l’échantillon à analyser.
      
      Nota : On a observé que pour les mélanges de MPT préparés à partir de cigarettes de tabac jaune commerciales « typiques » du Canada, des concentrations de 0, 25, 50, 75, 100, 125, 250 et 500 µg par plaque entraînent généralement une réaction satisfaisante. Pour les cigarettes non typiques, il sera nécessaire de procéder à une expérience de détermination des doses.
   3. Incuber les tubes dans l’agitateur-incubateur (100 à 120 tr/min) durant 20 ± 2 min à 37 ± 1 °C.
   4. Noter la présence de précipités dans le mélange réactionnel, s’il y a lieu.
   5. Après l’incubation, ajouter 2 mL de gélose de surface à chaque tube de mélange réactionnel et mélanger au vortex.
   6. Étaler le mélange de gélose de surface et de mélange réactionnel sur une gélose minimale au glucose.
      
      Nota : Faire les deux étapes ci-dessus en 20 secondes ou moins.
   7. Préparer trois plaques pour chaque concentration.
   8. Après la solidification de la couche de surface, inverser les plaques et incuber à 37 ± 1 °C pendant 48 à 72 heures.
4. Numération des colonies révertantes
   
   Nota : Normalement, lorsqu’on détermine la mutagénicité d’un échantillon, on tient compte du nombre de colonies obtenues sur trois plaques pour chaque concentration.
   1. Après l’incubation, examiner le tapis bactérien sur la plaque et compter le nombre de colonies révertantes.
   2. Noter le nombre de colonies révertantes pour chaque plaque.
   3. Noter tout signe d’éclaircissement ou de diminution du tapis bactérien.
   4. Noter la présence ou l’absence de tout précipité sur la plaque à essai.

13 Contrôle de la qualité et données à consigner

1. Produits chimiques et milieux de culture
   1. Vérifier et noter la stérilité des milieux, des réactifs et des solutions conformément aux bonnes pratiques utilisées dans les laboratoires de microbiologie. Vérifier les caractéristiques de performance des solutions témoins.
2. Génotype des souches d’essai
   1. Les souches utilisées pour l’essai doivent posséder toutes les caractéristiques génotypiques indiquées dans la présente méthode officielle. Voir article 9.2.2.
3. Témoins
   1. Pour évaluer le rendement global de l’essai, on doit inclure la cigarette Kentucky Reference 2R4F comme témoin dans l’échantillon. (Les résultats obtenus avec la cigarette témoin peuvent être comparés, au moyen de techniques statistiques appropriées, aux « valeurs prévues » établies par le laboratoire. Si le laboratoire n’a pas établi de valeurs prévues, on peut comparer les résultats obtenus avec la cigarette témoin aux valeurs relevées dans la documentation scientifique. Ce genre de comparaison renseigne sur l’exactitude et la précision de l’essai.)
   2. Chaque analyse doit comprendre des témoins positifs et des témoins de solvants en triple pour chaque souche d’essai utilisée.
   3. Des plaques en triple traitées par la solution témoin de solvant, avec et/ou sans activation métabolique, servent à la numération des colonies de fond (c.-à-d. témoins négatifs), conformément à la ligne directrice no 471 de l’OCDE, (1997).
      
      Nota : Par exemple, si on utilise du DMSO, la concentration de ce dernier ne devrait pas dépasser 4% v/v.
   4. Chaque fois qu’on utilise le mélange S9, on doit préparer également une plaque sans S9 comme témoin.
4. Évaluation des témoins négatifs
   1. La souche d’essai est mélangée à la gélose de surface et le tout est étalé sur une gélose minimale au glucose; cet étalement est fait en triple, lors de l’exécution de l’essai. Noter le nombre de colonies spontanément révertantes. Ce nombre devrait être vérifié fréquemment.
      
      Nota : Le nombre moyen de colonies comptées sur les plaques ensemencées en triple doit se situer dans un intervalle préalablement déterminé de manière appropriée (voir l’exemple présenté dans le tableau 1 ci-dessous).
      
      Nota : Chaque laboratoire doit déterminer et communiquer les intervalles d’acceptabilité pour chaque culture bactérienne en utilisant les méthodes statistiques appropriées. Par exemple, on peut déterminer les 5^e et 95^e percentiles à l’aide des données de contrôle recueillies durant des essais échelonnés sur plusieurs mois. Les valeurs obtenues deviendraient les seuils inférieur (5^e percentile) et supérieur (95^e percentile) d’acceptabilité.
      
      Le tableau suivant présente les intervalles typiques pour la numération des colonies secondaires de 5 souches différentes de Salmonella typhimurium. L’intervalle typique pour la numération des colonies en présence d’un témoin négatif était de 20 à 50 pour la souche TA98, de 70 à 200 pour la souche TA100, de 150 à 400 pour la souche TA102, de 5 à 20 pour la souche TA1535, et de 5 à 20 pour la souche TA1537.
      
      Tableau 1 : Intervalles typiques pour la numération des colonies de fond
      

      Souche de Salmonella typhimurium	Intervalle de numération typique pour les témoins négatifs (solvants)
      TA98	20-50
      TA100	70-200
      TA102	150-400
      TA1535	5-20
      TA1537	5-20

5. Évaluation des témoins positifs
   1. Il faut aussi préparer et traiter des cultures en triple avec une concentration précise d’un produit chimique reconnu pour entraîner une réponse mesurable, conformément à la ligne directrice no 471 de l’OCDE (1997), lorsque ces cultures sont évaluées en même temps que les échantillons (voir le tableau 2 ci-dessous). Pour chaque souche bactérienne, le nombre moyen de colonies compté sur les trois plaques du témoin positif doit être au moins trois fois plus élevé que celui observé avec le témoin négatif respectif. Le tableau 2 présente également des intervalles pour les nombres typiques de révertants par plaque qui seraient obtenus par l’exécution normale de la méthode à l’aide de la souche et des combinaisons de témoins chimiques sélectionnées.
      
      Le tableau suivant présente les intervalles de réponse typiques des témoins chimiques positifs. Les paramètres comprennent la présence ou l’absence d’activation par S9, la substance témoin positive utilisée, la concentration bactérienne et l’intervalle typique des souches bactériennes suivantes : TA98, TA100, TA1535, TA 1537, TA102, TA98, TA100, TA1535, TA1537 et TA102.
      
      Tableau 2 : Intervalles de réponse typiques pour les témoins chimiques positifs
      

      Souche bactérienn e	Activation par S9	Substance témoin positive	Concentration (µg/plaque)	Intervalle typique(révertants/plaque)
      TA98	+S9	2-aminoanthracène	2	1 250-2 100
      TA100	+S9	2-aminoanthracène	2	1 250-2 100
      TA1535	+S9	2-aminoanthracène	4	300-600
      TA1537	+S9	2-aminoanthracène	4	300-600
      TA102	+S9	2-aminoanthracène	7,5	1 450-2 100
      TA98	-S9	2-nitrofluorène	4	500-1 750
      TA100	-S9	Azide de sodium	1	400-600
      TA1535	-S9	Azide de sodium	1	400-600
      TA1537	-S9	9-aminoacridine	100	400-750
      TA102	-S9	Mitomycine C	0,5	1 150-1 600

6. Croissance bactérienne
   1. La densité de la culture bactérienne utilisée pour l’essai doit être au moins de 1 x 109 bactéries viables par mL de bouillon nutritif.
   2. L’examen régulier du tapis bactérien au microscope (faible grossissement) aide à déterminer la toxicité. L’éclaircissement du tapis bactérien indique habituellement que la concentration à l’essai se situe au delà de l’intervalle acceptable.

14 Analyse statistique et interprétation des résultats

1. Évaluation des variations d’une plaque à l’autre dans le cadre d’un essai
   1. Les critères utilisés pour ce test sont fondés sur les propriétés de la distribution du
      chi carré ( χ²), où (n - 1) [s²/σ²] ~ χ²_n-1
   2. Dans cette équation, n = 3 représente les résultats des plaques ensemencées en triple pour chaque concentration, s²étant la variance observée entre les plaques en triple pour chaque concentration et σ² étant la variance prévue pour chaque concentration.
   3. Le tableau 3 présente des estimations typiques prévues de la variance statistique (σ²) avec certaines combinaisons typiques de souche bactérienne et d’activation par S9 pour diverses concentrations de MPT. Ces estimations sont fondées sur l’exécution normale de la méthode.
   
   Le tableau suivant présente les estimations typiques de la variance de la numération des révertants sur des plaques de culture en triple exemplaire. Les variances présentées sont celles associées à plusieurs souches de bactéries à différentes concentrations (allant de 0 à 0,50 mg/plaque). Les souches bactériennes sont TA98, TA100, TA 1535, TA1537 et TA102. Chaque souche a été analysée avec et sans activation par S9.
   
   Tableau 3 : Estimations typiques de la variance pour les numérations de révertants sur les plaques ensemencées en triple
   

   Souche et activation par S9	Estimations de σ2 pour les plaques ensemencées en triple avec différentes concentrations de MPT* (mg/plaque)
   	0	0,025	0,050	0,075	0,100	0,125	0,250	0,500
   TA98 (+S9)	17	71	103	152	220	296	529	619
   TA98 (-S9)	5	6	10	7	10	10	10	12
   TA100 (+S9)	36	34	43	48	64	74	108	212
   TA100 (-S9)	57	55	50	58	51	71	125	100
   TA1535 (+S9)	2	2	3	3	3	5	4	7
   TA1535 (-S9)	2	4	4	5	4	4	5	8
   TA1537 (+S9)	4	7	10	11	16	18	22	32
   TA1537 (-S9)	4	5	6	6	6	6	8	3
   TA102 (+S9)	143	108	144	129	154	210	240	236
   TA102 (-S9)	115	124	120	151	162	95	143	160

   
   *Matière particulaire totale

15 Communication des résultats de l’essai

1. Les résultats à communiquer en matière de mutagénicité comprennent les éléments suivants, conformément à l’annexe 4 :
   • Code de l’échantillon (permettant de retracer la marque de cigarette)
   • Données sur le fumage (machine à fumer, date du fumage, nombre de bouffées, nombre de cigarettes fumées, quantité de matière particulaire totale)
   • Données de contrôle
   • Données chimiques (y compris la teneur en eau, en nicotine, en 1,2-propylèneglycol et en glycérol, s’il y a lieu)
   • Observations lors de l’essai : code de l’échantillon, souche, concentration, avec/sans S9, numération (pour chaque sous-échantillon), moyenne, écart- type.

16 Références

1. Ames, B.N., McCann, J., Yamasaki, E., Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-microsome Mutagenicity Test. Mutation Research 31:347-364, 1975.
2. Bernstein, L., Kaldor, J., McCann, J., Pike, M.C., An Empirical Approach to the Statistical Analysis of Mutagenesis Data From the Salmonella Test. Mutation Research, 97:267-281, 1982.
3. Edler, L., Statistical Methods for Short-term Tests in Genetic Toxicology: The First Fifteen Years. Mutation Research, 277:11-33, 1992.
4. Sokal, R.R., and Rohlf, F.J., Biometry. 3rd edition. W.H. Freeman and Co, San Francisco. pp. 493-521, 1995.
5. Yahagi, T., Degawa, M., Seino Y., Mat Sishima, T., Nagoa, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., Mutagenicity of Carcinogenic Azo Dyes and Their Derivatives. Cancer Letter 1, 91-96, 1975.

Annexes

Annexe 1
Collecte de matière particulaire totale (MPT) sur disque filtrant en fibre de verre

1 Résumé

1. La fumée principale de cigarettes (p. ex. 20 cigarettes) fumées sur une machine à fumer rotative selon les conditions ISO modifiées (intenses) est piégée par un disque filtrant en fibre de verre de 44 ou 92 mm de diamètre.
   
   Nota : Le nombre de cigarettes fumées doit faire en sorte que les filtres retiennent toute la MPT et que les limites de MPT définies dans la norme ISO 4387 soient respectées. Il est également possible qu’on doive ajuster le nombre de cigarettes de l’échantillon afin d’obtenir au moins

180 mg de MPT par filtre de 92 mm ou 100 mg de MPT par filtre de 44 mm.

2 Appareillage et équipement

1. Équipement nécessaire au conditionnement, conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Équipement nécessaire au marquage de la longueur des mégots, conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Équipement nécessaire au fumage mécanique des cigarettes, conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

3 Réactifs et matériel

Nota : Dans la mesure du possible, les réactifs doivent être désignés par leur numéro de registre CAS indiqué entre crochets. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique ou supérieure.

1. Éthanol [67-17-5] à 70 % (v/v)
2. Réactifs et matériel énumérés dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

4 Préparation de la verrerie

1. Laver et sécher la verrerie de manière à éviter toute contamination par des résidus.
2. Stériliser toute la verrerie de laboratoire nécessaire par autoclavage à 121 °C durant 30 minutes à une pression de 15 livres par pouce carré (psi).

5 Échantillonnage

1. L’échantillonnage des produits du tabac pour des analyses doit être effectué conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

6 Préparation des cigarettes

1. Marquer la longueur des mégots de cigarette conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Préparer les cigarettes à fumer conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Conditionner les cigarettes conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

7 Préparation de la machine à fumer

1. Les conditions ambiantes de fumage doivent être conformes à celles décrites dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Éviter tout éclairage ultraviolet dans les pièces où les échantillons sont produits ou analysés.
3. Les conditions relatives à la machine à fumer rotative doivent être conformes à celles décrites dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada. Noter le point suivant :
   • pour réduire la contamination bactérienne, nettoyer toutes les rondelles en néoprène et les joints à labyrinthe avec de l’éthanol à 70 %.
4. Pour réduire la contamination bactérienne, nettoyer les parties suivantes de la machine avec de l’éthanol à 70 % :
   • Plaque pour cendres
   • Canaux
   • Porte-filtres
   • Toutes les surfaces de travail, y compris l’extérieur des fioles à extraction et des bouchons
   • Tout autre article (p. ex. gants) qui pourrait entrer en contact avec l’échantillon ou les surfaces de travail nettoyées

8 Production de MPT

1. Fumer les cigarettes et recueillir la MPT conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada (avec les modifications suivantes) :
   • Modifications apportées aux conditions de fumage :
     • le volume de chaque bouffée est porté de 35 mL à 55 mL;
     • l'intervalle entre chaque bouffée est ramené de 60 s à 30 s;
     • tous les orifices de ventilation sont obturés soit par recouvrement du périmètre, de l'embout du filtre à la couture du papier de la manchette, d'une bande adhésive Mylar de marque Scotch (ruban transparent numéro 600) fermement collée, soit selon une autre méthode d'une efficacité équivalente.
   • Après le fumage du nombre requis de cigarettes, tirer trois bouffées nettoyantes et retirer le porte-filtre de la machine à fumer.
2. Le nombre de sous-échantillons à produire est celui stipulé dans la réglementation applicable. Tous les sous-échantillons doivent être analysés le même jour.
3. Mesurer la MPT conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
4. Après avoir mesuré la MPT, retirer le filtre du porte-filtre, le plier en quatre (le côté exposé à la MPT vers l’intérieur) et essuyer le porte-filtre avec le filtre plié.
5. Procéder à l’extraction de l’échantillon conformément à l’annexe 2.

Annexe 2 - Préparation de matière particulaire totale (MPT) à partir d’un disque filtrant en fibre de verre

1Résumé

1. La matière particulaire totale piégée sur un disque filtrant en fibre de verre est extraite au DMSO jusqu’à une concentration de 10 mg de MPT par mL de DMSO.

2 Appareillage et équipement

1. Centrifugeuse
2. Pipettes et embouts stériles (tailles variées)
3. Congélateur, -20 °C à -86 °C
4. Hotte, classe II, type B
5. Agitateur rotatif (200 tr/min)
6. Agitateur oscillant
7. Thermomètre
8. Chronomètres
9. Incubateur

3 Réactifs et matériel

Nota : Dans la mesure du possible, les réactifs doivent être désignés par leur numéro de registre CAS indiqué entre crochets. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique ou supérieure.

1. Disque filtrant en fibre de verre et porte-filtre
2. Erlenmeyer en polyméthylpentène (PMP) (125 mL), ou l’équivalent
3. Diméthylsulfoxyde (DMSO) [67-68-5]
4. Bouteilles ambrées stériles de 25 mL
5. Flacons ambrés stériles
6. Étamine stérile
7. Pipettes graduées jetables, stériles (5 mL et 10 mL)
8. Tubes coniques en plastique, jetables, stériles (capacité de 50 mL)
9. Pinces stériles
10. Entonnoirs stériles
11. Tubes à centrifugation gradués, stériles (15 mL et 50 mL)
12. Sac maillé en nylon stérile (p. ex. sacs à échantillons en tissu de Thermo Shandon)

4 Préparation de la verrerie

1. Stériliser toute la verrerie de laboratoire nécessaire par autoclavage à 121 °C, à une pression de 15 livres par pouce carré (psi), pendant le temps requis pour garantir la stérilité.

5 Préparation des échantillons

Nota : Stériliser/désinfecter le matériel et les surfaces de travail afin de réduire au minimum la contamination de fond, et ce, pour toutes les procédures.

Nota : Si le disque filtrant en fibre de verre préparé selon les instructions de l’annexe 1 ne fait pas l’objet d’une extraction immédiate, on peut le conserver dans une fiole hermétiquement fermée à -70 °C ou moins. Laisser les disques atteindre la température ambiante avant de procéder à l’extraction au DMSO.

1. Déposer le disque filtrant en fibre de verre préparé selon les directives de l’annexe 1 dans un erlenmeyer de 125 mL en PMP stérile.
2. Pipeter la quantité appropriée de DMSO dans la fiole pour obtenir la concentration cible de 10 mg de MPT par mL de DMSO. Le volume de DMSO requis pour préparer une solution de MPT de 10 mg/mL peut être déterminé au moyen du calcul suivant :
   Volume (mL) = Poids total de la MPT/10
   Nota : Le volume de DMSO à ajouter est arrondi à deux décimales.
3. Agiter l’erlenmeyer en PMP durant 20 minutes avec un agitateur oscillant.
4. Filtrer l’échantillon extrait au DMSO dans un tube à centrifugation stérile de 50 mL à travers de l’étamine stérile pour enlever la matière du disque filtrant.
   
   Nota : Si la MPT a été recueillie sur un disque filtrant en fibre de verre de 44 mm, on peut aussi enlever la matière du disque comme suit :
   • Faire agiter le disque avec la quantité appropriée de DMSO dans une bouteille ambrée de 25 mL au moyen d’un agitateur rotatif.
   • Verser l’échantillon extrait au DMSO dans un sac maillé stérile placé dans un tube à centrifugation conique. Centrifuger à 1500 tr/min pendant 5 minutes.
5. Préparer une ou plusieurs aliquotes de l’échantillon extrait au DMSO dans des fioles ambrées stériles préalablement étiquetées. Cet extrait constitue la solution-mère de MPT.
6. Vérifier la stérilité de la solution-mère de MPT en étalant une certaine quantité de celle-ci sur une gélose nutritive et en incubant la gélose à 37 °C pendant 48 heures.
7. Conserver toutes les solutions à -70 °C, ou moins, jusqu’au moment de les utiliser.

Annexe 3 - Dosage du glycérol, du menthol, de la nicotine, du 1,2-propylèneglycol, de l’eau et du goudron conjointement avec l’analyse de la matière particulaire totale (MPT)

1 Résumé de la méthode

1. La matière particulaire totale (MPT), provenant soit de séries de fumage en parallèle (alternance de fumage nicotine-eau et de fumage Ames) soit d’un sous-échantillon de MPT utilisé dans le test d’Ames, est extraite conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.|
   
   Nota : Lorsqu’on utilise des séries de fumage en parallèle, il faut fumer le même nombre de cigarettes que celui servant à la production de MPT pour le test d’Ames.
2. Une aliquote de l’extrait est utilisée pour la mesure des teneurs en nicotine et en eau, conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Une deuxième aliquote est utilisée pour le dosage du glycérol, du menthol et du 1,2-propylèneglycol, conformément à la méthode officielle T-304 de Santé Canada. Cette analyse produit également des données sur la nicotine.
4. La teneur en eau de deux tampons inutilisés est mesurée en même temps que celle de chaque échantillon soumis à une analyse chimique, ce qui permet de mesurer adéquatement la valeur du blanc d’échantillon et d’effectuer une correction pour l’eau.
5. Le dosage est réalisé à l’aide d’un étalon interne. On détermine la réponse des analytes présents dans les échantillons avec un détecteur à ionisation de flamme (DIF) ou un détecteur à conductivité thermique (DCT) et on la compare à une courbe d’étalonnage multipoint produite au moyen des étalons correspondants.

2 Appareillage et équipement

1. Équipement décrit dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Équipement décrit dans la méthode officielle T-304 de Santé Canada.

3 Réactifs et matériel

Nota : Dans la mesure du possible, les réactifs doivent être désignés par leur numéro de registre CAS indiqué entre crochets. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique ou supérieure.

1. Réactifs décrits dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Réactifs décrits dans la méthode officielle T-304 de Santé Canada.
3. Menthol [89-78-1] distillé dans du verre

4 Préparation des solutions

1. Préparer les solutions conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

5 Préparation des étalons

1. Préparer les étalons conformément aux méthodes officielles T-115 et T-304 de Santé Canada en utilisant le trans-anéthole comme étalon interne pour la méthode T-304.
2. Préparation de l’étalon de menthol
   1. Solution-mère primaire de menthol – Dissoudre 1 g de menthol avec la solution d’extraction dans une fiole jaugée de 100 mL.
   2. Solution-mère secondaire – Verser 5 mL de la solution-mère primaire de menthol dans une fiole jaugée et 5 mL des solutions-mères primaires de glycérol, de 1,2-propylèneglycol et de nicotine, puis compléter le volume à 100 mL avec la solution d’extraction.
   3. Étalon de concentration faible – Verser 1 mL de solution-mère secondaire et compléter le volume à 50 mL avec la solution d’extraction (menthol 0,01 mg/mL).
   4. Étalon de concentration moyenne - Verser 10 mL de solution-mère secondaire et compléter le volume à 50 mL avec la solution d’extraction (menthol 0,1 mg/mL).
   5. Étalon de concentration élevée - Verser 25 mL de solution-mère secondaire et compléter le volume à 50 mL avec la solution d’extraction (menthol 0,5 mg/mL).

6 Préparation de la verrerie

1. Laver et sécher la verrerie de manière à éviter toute contamination par des résidus.

7 Préparation de l’échantillon

1. Recueillir la MPT conformément à l’annexe 1.
   
   Nota : Il est possible que deux collectes distinctes de MPT soient nécessaires : une première pour le test d’Ames et une seconde pour l’analyse des composés chimiques. Lorsqu’on utilise des séries de fumage en parallèle, il faut fumer le même nombre de cigarettes que celui servant à la production de MPT pour le test d’Ames.
2. La préparation de la MPT en vue de l’analyse chimique doit se faire conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada, mais avec les modifications suivantes :
   1. Couper le filtre en quatre au lieu de le plier.
   2. Utiliser des erlenmeyers de 125 mL.
   3. Préparer deux blancs pour chaque échantillon fumé.
   4. Ajouter 80 mL de solution d’extraction dans les erlenmeyers.
   5. Envelopper les erlenmeyers dans du papier d’aluminium après y avoir ajouté la solution d’extraction.
   6. Agiter les échantillons et les blancs durant 30 minutes à l’aide d’un agitateur oscillant.

8 Analyse des échantillons

1. Doser le goudron et la nicotine, et déterminer la teneur en eau conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

8.2 Dosage du glycérol, du 1,2-propylèneglycol et du menthol

1. Le glycérol, la nicotine, le 1,2-propylèneglycol et le menthol sont dosés conformément à la méthode officielle T-304 de Santé Canada, mais avec les modifications suivantes :
   • La solution d’extraction utilisée est celle décrite dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
   • L’étalon interne est le trans-anéthole, tel qu’indiqué dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
   • Analyser deux blancs par série d’échantillons.
   • Préparer l’étalon de menthol conformément à la section 5.2.
   • Doser le menthol et la nicotine de la façon indiquée dans la méthode T-304 pour les humectants, en utilisant le trans-anéthole comme étalon interne.

9 Calculs

1. Les calculs sont effectués conformément aux méthodes officielles T-115 et T-304 de Santé Canada (à l’aide de l’étalon interne approprié).
2. Combiner les teneurs calculées pour chaque série indépendante.

10 Contrôle de la qualité

1. Se reporter aux méthodes officielles T-115 et T-304 de Santé Canada pour connaître les mesures de contrôle de la qualité.

Annexe 4
Présentation des données de l’essai de mutation réverse d’ames

1 Codes des échantillons

Le tableau suivant présente une description des échantillons de cigarette à tabac correspondant à certains codes d’identification du laboratoire.

2 Données sur le fumage

Le tableau suivant présente les données sur le fumage issues d’une série d’analyses du groupe 1. Quatre échantillons (030001, 030002, 030003, et 030004) ont chacun été analysés avec 3 sous-échantillons. Le tableau indique la date du fumage et le nombre de cigarettes fumées; il précise aussi si la machine à fumer rotative a été utilisée. Le nombre de bouffées par cigarette allait de 6,9 à 8,7. Le poids de la matière particulaire totale dans la fumée principale de tabac est indiqué en mg. 

* Échantillons extraits au DMSO à une concentration finale de 10,0 mg/mL. MPT FP : matière particulaire totale de fumée principale.

3 Données sur les témoins

Le tableau suivant présente les données sur les témoins de plusieurs souches bactériennes, en l’occurrence un témoin négatif et trois témoins positifs. Il indique, pour chaque échantillon, la date de l’essai, la concentration du témoin positif utilisé et le nombre de colonies.

4 Données chimiques

Le tableau suivant présente les données chimiques issues des séries d’analyses réalisées sur les groupes 1 à 5. Toutes les analyses portaient sur 5 sous-échantillons de l’échantillon 030001. Le nombre de bouffées par cigarette allait de 0,1 à 7,3, la matière particulaire totale dans la fumée principale de tabac allait de 0,3 à 13,2 mg/cigarette, la teneur en nicotine allait de 0,38 à 0,912 mg/cigarette, la teneur en goudron allait de 0,2 à 10,2 mg/cigarette, et la teneur en glycérol allait de 0,03 à 1,14 mg/cigarette. La teneur en propylène glycol dans l’ensemble des échantillons allait de non quantifiée à < 0,0008 mg/cigarette.

5 Réponse moyenne

Le tableau suivant présente les réponses moyennes de trois sous-échantillons de l’échantillon 030001. Chaque sous-échantillon a été analysé avec différentes concentrations de la substance chimique d’essai (exprimées en ug/plaque). La moyenne et l’écart-type de 5 souches (TA98, TA100, TA1535, TA537 et TA102) en présence d’une activation par S9 ont été notés.

6 Observations (exemple avec S9)

Le tableau suivant présente les observations faites concernant trois sous-échantillons de l’échantillon 030001. Chaque sous-échantillon a été analysé à différentes concentrations (exprimées en ug/plaque). Les résultats de la numération sur des plaques de culture en triple exemplaire de 5 souches (TA98, TA100, TA1535, TA537, et TA102) en présence d’une activation par S9 ont été notés.