Essai in vitro du micronoyau avec de la fumée principale de tabac

Santé Canada
T-503 Deuxième édition
01 novembre 2004

Table des matières

1. Portée
2. Normes applicables
3. Définitions et abréviations
4. Résumé de la méthode
5. Appareillage et équipement
6. Réactifs et matériel
7. Préparation de la verrerie et du matériel en plastique
8. Préparation des solutions et des milieux
9. Préparation de la suspension de cellules CHO
10. Collecte de la matière particulaire totale de la fumée
11. Préparation de l’échantillon d’essai
12. Test de clastogénicité et de génotoxicité (essai in vitro du micronoyau)
13. Contrôle de la qualité et données à consigner
14. Communication des résultats de l’essai
    
15. Références
16. Annexes

1 Portée

1. Le présent document décrit l’analyse de la matière particulaire totale (MPT) de la fumée principale de tabac avec des cellules ovariennes de hamster nain de Chine soumises à l’essai in vitro du micronoyau.

2 Normes applicables

1. Méthode officielle T-115 de Santé Canada : Dosage du goudron, de la nicotine et du monoxyde de carbone (CO) dans la fumée principale de tabac, deuxième édition, 2003. (Dispositions relatives aux cigarettes fabriquées seulement)
2. Organisation internationale de normalisation, norme ISO 4387 : Cigarettes – Détermination de la matière particulaire totale et de la matière particulaire anhydre et exempte de nicotine au moyen d'une machine à fumer analytique de routine, troisième édition, 2000.

3 Définitions et abréviations

1. Cellules CHO : Cellules ovariennes de hamster nain de Chine.
2. CMF-PBS : Solution saline tamponnée au phosphate sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium.
3. CP : Cyclophosphamide.
4. Disque filtrant (tampon) en fibre de verre : Tampon utilisé pour recueillir la matière particulaire de la fumée de tabac.
5. DMSO : Diméthylsulfoxyde.
6. Fraction hépatique de rat S9 : Surnageant d’homogénat de cellules hépatiques obtenues de rats mâles exposés à une substance stimulant l’activité enzymatique (telle que l’Aroclor-1254, le phénobarbitone ou le ß-naphthoflavone). Cette fraction permet de simuler in vitro les réactions d’activation métabolique qui ne se produisent généralement que dans le foie des mammifères.
7. Hémocytomètre : Lame quadrillée spéciale utilisée en microscopie pour compter le nombre de cellules dans une suspension.
8. Matière particulaire totale : Partie de la fumée principale qui est piégée par le disque filtrant en fibre de verre.
9. Micronoyau (MN) : Petit corps extranucléaire formé durant la mitose à partir de fragments de chromosomes acentriques ou des chromosomes entiers qui ne sont intégrés dans le noyau d’aucune des deux cellules-filles.
10. MMC : Mitomycine C.
11. NADP : Nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate.

4 Résumé de la méthode

1. Des cigarettes (p. ex. 20 cigarettes) sont fumées selon les conditions ISO modifiées (intenses) à l’aide d’une machine à fumer rotative à 20 canaux.
2. On fait passer la fumée principale à travers un disque-filtrant en fibre de verre de 44 ou 92 mm pour recueillir la MPT.
3. On prépare une solution de MPT à une concentration d’environ 10 mg de matière particulaire totale/mL de DMSO.
4. On traite des cellules ovariennes de hamster nain de Chine (CHO) avec différentes concentrations de la solution de MPT dans un flacon de culture tissulaire (en double). Il incombe à chaque laboratoire de déterminer la durée du cycle de réplication et d’ajuster les schémas de traitement et de récupération en conséquence. Voici un exemple de schéma de traitement : (i) exposition de courte durée (p. ex. 3 heures) sans activation métabolique, suivie d’une période de récupération (p. ex. 27 heures), (ii) exposition de courte durée (p. ex. 3 heures) avec activation métabolique, suivie d’une période de récupération (p. ex. 27 heures) et (iii) exposition continue de longue durée (p. ex. 30 heures) sans activation métabolique.
   
   Nota 1 : Des témoins négatif (solvant) et positif sont analysés simultanément.
   
   Nota 2 : Les traitements peuvent tous être amorcés simultanément, ou les traitements (i) et (ii) peuvent être effectués en premier, le traitement (iii) servant d’épreuve de confirmation dans l’éventualité de résultats négatifs ou douteux avec les traitements (i) et (ii).
5. L’essai in vitro du micronoyau est effectué sans cytochalasine B.
6. Après le traitement, on récolte les cellules par trypsinisation, puis on les fixe.
7. On prépare des lames à l’aide d’une cytocentrifugeuse. On peut aussi déposer une goutte de cellules, étaler les cellules ou préparer des frottis sur des lames propres.
8. On colore les cellules à l’aide du colorant à l’acridine orange afin de détecter les micronoyaux (MN).
9. On examine au moins 1 000 cellules en interphase choisies au hasard dans chaque flacon pour déceler la présence de micronoyaux.

Mise en garde : L’analyse et l’évaluation de certains produits par cette méthode peuvent exiger l’utilisation de matériel et/ou d’équipement potentiellement dangereux. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les aspects de sécurité associés à l’utilisation de la méthode. Il incombe à l’utilisateur de consulter les autorités compétentes et de déterminer au préalable les pratiques adéquates de santé et sécurité, conformément aux exigences réglementaires applicables."

5 Appareillage et équipement

1. Équipement requis pour la collecte de la matière particulaire totale et la préparation des échantillons, conformément aux annexes 1 et 2
2. Microscope inversé (ou l’équivalent)
3. Enceinte de sécurité biologique à flux laminaire de classe II, type B
4. Étuve à CO₂
5. Pipettes automatiques
6. Cytocentrifugeuse (Cytospin)
7. Sèche-lame
8. Microscope à fluorescence muni des filtres requis pour la coloration à l’acridine orange
9. Compteur à touches
10. Flacons de culture tissulaire
11. Pipettes jetables stériles de 10 mL
12. Pipettes jetables stériles de 5 mL
13. Hémocytomètre
14. Tubes jetables stériles de 15 mL
15. Bain-marie
16. Lames de verre et lamelles
17. Balance
18. pH-mètre

6 Réactifs et matériel

Nota : Lorsque c’est possible, identifier les réactifs en indiquant leur numéro de registre CAS entre crochets. Dans la mesure du possible, utiliser des réactifs de qualité analytique.

1. Sérum de veau fœtal
2. Cellules CHO
3. Mélange nutritif (HAM F12 avec L-glutamine et NaHCO₃)
4. Solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (CMF-PBS)
5. Pénicilline et streptomycine (p. ex. en solution ou sous forme de poudre)
6. Solution de bleu trypan (0,4 %) [72-57-1]
7. Trypsine [9002-07-7], ou l’équivalent
8. Diméthylsulfoxyde [67-68-9]
9. Mitomycine C [50-07-7]
10. Colchicine [64-86-8]
11. Cyclophosphamide [6055-19-2]
12. Fraction hépatique de rat S9
13. NADP [1184-16-3]
14. Acide isocitrique [1637-73-6]
15. Méthanol [67-56-1]
16. Acide acétique glacial [64-19-7]
17. Tampon phosphate (p. ex. Sorenson)
18. Acridine orange
19. Milieu de montage
20. Eau stérile désionisée
21. Filtre stérile de 0,2 µm
22. Réactifs et matériel nécessaires à la collecte et à la préparation des échantillons d’essai, conformément aux annexes 1 et 2

7 Préparation de la verrerie et du matériel en plastique

1. La verrerie et le matériel en plastique doivent être stériles, propres et, si nécessaire, jetables.
2. Nettoyer les articles requis pour la collecte et la préparation des échantillons d’essai conformément aux annexes 1 et 2.

8 Préparation des solutions et des milieux

Nota 1 : Préparer tous les réactifs et les milieux en appliquant les techniques d’asepsie standard et, s’il y a lieu, les directives du fabricant concernant la préparation des solutions.

Nota 2 : Préparer les produits qui pourraient être cancérigènes ou toxiques dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire en prenant les précautions qui s’imposent selon le produit.

1. Préparer tout le milieu de culture nécessaire en combinant du mélange nutritif et du sérum de veau fœtal dans une proportion de 90:10 et en ajoutant 100 unités de pénicilline/mL et 100 µg de streptomycine/mL.
   
   Nota : Le milieu de culture sert aussi de diluant dans l’essai en l’absence d’un système d’activation métabolique.
2. Préparer la solution CMF-PBS en suivant les directives du fabricant.
3. Préparer une solution de trypsine à 0,25 % (p/v) dans de la solution CMF-PBS avant de procéder à l’essai.
4. Préparer la solution de fixation en mélangeant de l’acide acétique glacial et du méthanol (1:3 v/v).
   
   Nota : D’autres solutions de fixation peuvent être utilisées s’il y a lieu.
5. Préparer la quantité nécessaire de mélange S9 [article 12.3.2] la journée de l’essai selon l’ordre indiqué :

   Ingrédients	(pour 0,275 mL de mélange S9)
   Solution d’acide isocitrique (13.5 %, w/v, FW 258.1)	0,100 mL
   Solution de NADP (75 mg/mL, FW 765.4)	0,100 mL
   Fraction hépatique de rat S9	0,075 mL

6. Préparation des solutions témoins négatives
   1. Se servir comme témoin négatif de DMSO dans le milieu de culture. Utiliser le même volume de DMSO que celui présent dans l’échantillon d’essai dont la concentration est la plus élevée.
7. Préparation des solutions témoins positives
   1. Solution de mitomycine C (MMC)
      1. Préparer une solution-mère de MMC (p. ex. 2 mg de MMC/4 mL d’eau stérile désionisée).
      2. Au début de l’essai, préparer des solutions de travail de MMC de concentrations adéquates (p. ex. en l’absence d’un système d’activation métabolique : 2,0 µg/mL de milieu de culture pour le traitement de courte durée ou 0,5 µg/mL de milieu de culture pour le traitement continu de longue durée).
   2. Solution de colchicine
      1. Préparer une solution-mère de colchicine (p. ex. 10 mg de colchicine/10mL d’eau stérile désionisée).
      2. Au début de l’essai, préparer des solutions de travail de colchicine de concentrations adéquates (p. ex. en l’absence d’un système d’activation métabolique : 2,0 µg/mL de milieu de culture pour le traitement de courte durée ou 0,5 µg/mL de milieu de culture pour le traitement continu de longue durée).
   3. Solution de cyclophosphamide (CP)
      1. Préparer une solution-mère de cyclophosphamide (p. ex. 75 mg de CP/10 mL eau stérile désionisée).
      2. Au début de l’essai, préparer une solution de travail de CP de concentration adéquate (p. ex. en présence d’un système d’activation métabolique :
         7,5 µg/mL de milieu de culture pour le traitement de courte durée).
8. Préparation de la solution de coloration
   1. Préparer une solution-mère d’acridine orange (p. ex. 10 mg d’acridine orange/4 mL de tampon phosphate).
   2. Préparer une solution de travail d’acridine orange de concentration adéquate (p. ex. 20 µL de solution-mère d’acridine orange dans 50 mL de tampon phosphate).

9 Préparation de la suspension de cellules CHO

1. Calculer la quantité de suspension de cellules CHO à récolter pour effectuer l’essai. Il faut 5 mL d’une suspension contenant 100 000 cellules viables/mL pour chaque flacon de culture de 25 cm² (50 mL).
   
   Nota : Préparer et utiliser deux flacons pour chaque concentration de l’échantillon, le témoin négatif (solvant) et le témoin positif.
2. Les cellules CHO sont cultivées en monocouche dans des flacons de qualité culture tissulaire à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂. Lorsque les cellules sont presque à confluence, elles peuvent être récoltées ou sous-cultivées par trypsinisation comme suit :
   1. Enlever le milieu de culture.
   2. Ajouter de la solution CMF-PBS pour rincer.
   3. Jeter la solution de rinçage.
   4. Ajouter de la solution CMF-PBS une deuxième fois pour rincer.
   5. Jeter la solution de rinçage.
   6. Ajouter de la solution de trypsine à 0,25 % à la monocouche pendant le temps voulu, puis enlever la solution. La quantité de solution de trypsine ajoutée dépend de l’âge de la solution.
   7. Ajouter du milieu de culture frais au flacon et bien mélanger afin d’obtenir une suspension de cellules individuelles.
3. Numération des cellules CHO dans une suspension de cellules individuelles
   1. Mélanger 0,5 mL de la suspension cellulaire et 0,5 mL d’une solution de bleu trypan à 0,4 %.
      
      Nota : Il faut être prudent lorsqu’on travaille avec le bleu trypan, car il est toxique et pourrait être cancérigène.
   2. Laisser reposer le mélange pendant au moins 5 minutes, mais pas plus de 15 minutes.
   3. S’assurer que l’hémocytomètre est propre et sec avant son utilisation. Recouvrir l’hémocytomètre d’une lamelle.
      
      Nota : Une autre option serait d’utiliser un compteur de cellules automatique.
   4. Déposer la suspension de cellules et de bleu trypan dans la chambre de l’hémocytomètre à l’aide d’un tube capillaire ou d’un autre dispositif adéquat. Ne pas trop remplir ni sous-remplir les chambres.
   5. Compter le nombre de cellules viables et de cellules non viables dans 4 carrés des coins et 1 carré central. Les cellules non viables sont colorées en bleu.
   6. Calculer le nombre moyen de cellules viables par carré.
   7. Calculer le nombre de cellules viables par mL de suspension cellulaire comme suit :
      
      Cellules viables/mL = (nombre moyen de cellules/carré) x (facteur de dilution) x 10⁴ (facteur de conversion de la chambre).
      
      Exemple : (125 cellules) x (2) x 10⁴ = 2,5 x 10⁶ cellules/mL.
   8. Après avoir déterminé le nombre de cellules, on peut diluer la suspension cellulaire avec le milieu de culture et ensemencer les flacons de culture tissulaire à une densité de 1 x 10⁵ cellules/mL. Il faut 5 mL d’une solution contenant 100 000 cellules viables/mL pour chaque flacon de culture de 25 cm² (50 mL).
      
      Nota : Préparer et utiliser deux flacons pour chaque concentration de l’échantillon, le témoin négatif (solvant) et le témoin positif.

10 Collecte de la matière particulaire totale de la fumée

1. Consulter l’annexe 1 : Collecte de la matière particulaire totale à l’aide d’un disque filtrant en fibre de verre.

11 Préparation de l’échantillon d’essai

1. Consulter l’annexe 2 : Préparation de la matière particulaire totale (MPT) à partir d’un disque filtrant en fibre de verre.

12 Test De Clastogénicité Et De Génotoxicité (Essai In Vitro Du Micronoyau)

1. Préparation du flacon de culture tissulaire
   1. Déposer 5 mL de la suspension cellulaire dans chacun des flacons de culture tissulaire de 25 cm² (50 mL).
      
      Nota : Si un volume autre que 5 mL est utilisé, tous les autres volumes devront être ajustés en conséquence.
   2. Confirmer la présence ou l’absence de cellules CHO à l’aide d’un microscope inversé.
   3. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant 24 ± 3 heures.
2. Préparation des concentrations voulues d’échantillons et de témoins pour l’essai
   1. Préparer les concentrations voulues du témoin négatif, de l’échantillon de fumée de cigarette (MPT) ou du témoin positif en ajoutant la quantité adéquate de milieu de culture.
      
      Nota 1 : Il pourrait être nécessaire de procéder à une expérience de détermination des doses pour s’assurer que l’échantillon d’essai le plus concentré produit une toxicité d’environ 60 % comparativement au témoin négatif (solvant). (Voir le point 12.4.3 pour savoir comment déterminer la toxicité.)
      
      Nota 2 : En ce qui concerne les cigarettes fabriquées avec du tabac jaune vendues couramment au Canada, des concentrations de 0, 75, 100, 150 et 200 µg de MPT/mL donnent généralement une réponse satisfaisante dans le traitement de courte durée.
      
      Nota 3 : Le solvant utilisé pour la préparation des dilutions doit être le même que celui utilisé pour la préparation de l’échantillon d’essai (p. ex. DMSO).
3. Exposition de courte et de longue durée des cellules CHO
   1. Traitement de courte durée sans activation métabolique, suivi d’une période de récupération – Schéma (i)
      1. Retirer le milieu de culture de chaque flacon.
      2. Traiter chaque flacon en y ajoutant 5 mL de milieu de culture contenant soit le témoin négatif, soit le témoin positif, soit la fraction de MPT à différentes concentrations.
         
         Nota : Les concentrations suggérées de MPT sont les suivantes : 0, 75, 100, 150 et 200 µg de MPT/mL de milieu de culture. (Ces doses habituelles incluent probablement la concentration de MPT qui peut produire une cytotoxicité d’environ 60 %, comparativement au solvant utilisé comme témoin négatif.)
      3. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant le temps voulu (p. ex. 3 heures).
      4. Retirer des flacons le milieu contenant le solvant, le témoin positif ou les échantillons de MPT de différentes concentrations.
      5. Rincer les flacons avec la solution CMF-PBS.
      6. Ajouter à chaque flacon 5 mL de milieu de culture frais seulement.
      7. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant une période correspondant approximativement à deux cycles de réplication après le début du traitement (p. ex. 27 heures).
   2. Traitement de courte durée avec activation métabolique, suivi d’une période de récupération – Schéma (ii)
      1. Retirer le milieu de culture de chaque flacon.
      2. Traiter les flacons en déposant dans chacun 4,625 mL de mélange nutritif HAM F12 sans sérum auquel on a ajouté soit le témoin négatif, soit le témoin positif, soit la MPT à différentes concentrations à raison de 0,1 mL. Ajouter également à chaque flacon 0,275 mL de mélange S9 [article 8.5].
         
         Nota : Les concentrations suggérées de MPT sont les suivantes : 0, 75, 100, 150 et 200 µg de MPT/mL de milieu de culture. (Ces doses habituelles incluent probablement la concentration de MPT qui peut produire une cytotoxicité d’environ 60 %, comparativement au solvant utilisé comme témoin négatif.)
      3. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant le temps voulu (p. ex. 3 heures).
      4. Retirer des flacons le milieu contenant le solvant, le témoin positif ou les échantillons de MPT de différentes concentrations.
      5. Rincer les flacons avec la solution CMF-PBS.
      6. Ajouter à chaque flacon 5 mL de milieu de culture frais seulement (mélange nutritif HAM F12 avec sérum).
      7. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant une période correspondant approximativement à deux cycles de réplication après le début du traitement (p. ex. 27 heures).
   3. Traitement continu de longue durée sans activation métabolique – Schéma (iii)
      1. Retirer le milieu de culture de chaque flacon.
      2. Traiter chaque flacon en y ajoutant 5 mL de milieu de culture contenant soit le témoin négatif, soit le témoin positif, soit la MPT à différentes concentrations.
         
         Nota : Les concentrations suggérées de MPT sont les suivantes : 0, 75, 100, 150 et 200 µg de MPT/mL de milieu de culture. (Ces doses habituelles incluent probablement la concentration de MPT qui peut produire une cytotoxicité d’environ 60 %, comparativement au solvant utilisé comme témoin négatif.)
      3. Incuber les flacons à 37 ± 1 °C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ pendant une période correspondant approximativement à deux cycles de réplication après le début du traitement (p. ex. 30 heures).
4. Récolte et numération des cellules
   1. Les cellules peuvent être détachées de la surface du flacon par trypsinisation, conformément à la section 9.2.
   2. Compter le nombre total de cellules obtenues avec le témoin négatif (solvant) et avec les cultures traitées conformément à la section 9.3.
   3. On peut évaluer la prolifération et la toxicité cellulaires en comparant le nombre de cellules présentes lors de l’ensemencement ou au début du traitement et le nombre de cellules présentes au moment de la récolte, et ce, pour les cultures de cellules traitées et de cellules témoins. Voir les sections 9.3 et 14.
5. Coloration des micronoyaux
   1. Fixer les cellules à l’aide d’un fixateur (p. ex. acide acétique glacial:méthanol, 1:3 v/v) et préparer des lames à l’aide d’une cytocentrifugeuse. On peut aussi déposer une goutte de cellules, étaler les cellules ou préparer des frottis sur des lames propres.
   2. Colorer les cellules à l’acridine orange, selon la procédure suivante si voulu :
      1. Plonger la lame dans la solution de travail d’acridine orange [article 8.8.2].
      2. Colorer pendant cinq minutes.
      3. Rincer la lame immédiatement en la plongeant dans de l’eau désionisée stérile.
      4. Recouvrir les cellules d’une lamelle couvre-objet avec milieu de montage.
6. Détermination de la présence de micronoyaux
   1. Examiner au moins 1 000 cellules choisies au hasard dans chaque flacon de culture pour déterminer si elles renferment des micronoyaux. Examiner au total 2 000 cellules par concentration (1 000 cellules par culture; deux cultures par concentration) pour déterminer si elles renferment des micronoyaux. Considérer comme des micronoyaux les noyaux qui ne dépassent pas le tiers du diamètre du noyau principal, qui ne recouvrent pas partiellement le noyau principal et dont le contour est net.

13 Contrôle de la qualité et données à consigner

1. Produits chimiques et milieux
   1. Vérifier la stérilité des milieux, des réactifs et des solutions et consigner les résultats conformément aux bonnes pratiques de laboratoire qui s’appliquent aux laboratoires de culture tissulaire. Vérifier les caractéristiques de performance des solutions témoins.
2. Maintien des cultures cellulaires
   1. Examiner chaque jour les cultures cellulaires à l’aide d’un microscope inversé et noter tout changement dans la morphologie et les propriétés d’adhésion.
   2. Examiner régulièrement les cellules pour s’assurer qu’elles ne sont pas contaminées par Mycoplasma et ne les utiliser que si aucune contamination n’a été observée.
   3. La fréquence de base des micronoyaux dans la lignée cellulaire doit être inférieure à 25/1 000 cellules.
3. Témoins
   1. Pour évaluer le rendement global de l’essai, on doit inclure la cigarette Kentucky Reference 2R4F comme témoin dans l’échantillon. (Les résultats obtenus avec la cigarette témoin peuvent être comparés, au moyen de techniques statistiques appropriées, aux « valeurs prévues » établies par le laboratoire. Si le laboratoire n’a pas établi de valeurs prévues, on peut comparer les résultats obtenus avec la cigarette témoin aux valeurs relevées dans la documentation scientifique. Ce genre de comparaison renseigne sur l’exactitude et la précision de l’essai.)
   2. Au moment de la récolte, le nombre de cellules dans les cultures du témoin négatif (solvant) devrait avoir augmenté d’au moins 90 %, conformément à la section 12.4.3.
   3. Les pourcentages relatifs moyens de cellules micronucléées (% CMN) et de micronoyaux (% MN) du témoin positif doivent satisfaire au critère d’acceptation défini par chaque laboratoire.
   4. Il faut coder les lames avant l’analyse afin de réduire au minimum la possibilité de biais lié à l’opérateur.
4. Toxicité
   1. La concentration la plus élevée de l’échantillon à l’essai doit provoquer une toxicité égale ou inférieure à environ 60 %.

14 Déclaration des résultats de l’essai

1. Les rapports d’essai doivent comporter les éléments suivants (voir les exemples à l’annexe 3) :
   • Identification de l’échantillon (pour référence à la marque de cigarette);
   • données sur le fumage (identification de la machine à fumer, date du fumage, nombre de bouffées, nombre de cigarettes fumées, matière particulaire totale);
   • numérations cellulaires brutes pour l’essai du micronoyau (nombre de cellules normales pour 1 000 cellules observées, nombre de cellules micronucléées pour
   • 1 000 cellules observées, nombre total de micronoyaux pour 1 000 cellules observées et nombre de cellules viables par mL de suspension cellulaire) pour le témoin positif et toutes les concentrations de MPT utilisées;
   • nombre de cellules viables par mL de suspension cellulaire lors de l’ensemencement et de la récolte.

15 Références

1. Fenech, M. (2000) The in vitro micronucleus technique. Mutation Research 455:81-95.
2. Garriott, M.L., Barry Phelps, J., and Hoffman, W.P. (2002) A protocol for the in vitro micronucleus test I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research 517:123-134.
3. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A., and Wakata, A. (2003) Report from the in vitro micronucleus working group. Mutation Research 540:153-163.
4. Matshushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K., and Sofuni, T. (1999) Validation study of the in vitro micronucleus test in Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis 14(6):569-580.
5. Massey, E., Aufderheide, M., Koch, W., Lodding, H., Pohlmann, G., Windt, H., Jarck, P., and Knebel, J.W. (1998) Micronucleus induction in V79 cellules after direct exposure to whole cigarette smoke. Mutagenesis 13(2):145-149.

Annexes

Annexe 1
Collecte de matière particulaire totale (MPT) sur disque filtrant en fibre de verre

1 Résumé

1. Des cigarettes (p. ex. 20 cigarettes) sont fumées sur une machine à fumer rotative selon les conditions ISO modifiées (intenses). La MPT est piégée sur un disque filtrant en fibre de verre de 44 mm ou de 92 mm de diamètre.
   
   Nota : La quantité de cigarettes fumées doit être telle que le filtre puisse retenir toute la MPT et que les limites de MPT définies dans la norme ISO 4387 soient respectées. Il est également possible qu’on doive modifier le nombre de cigarettes dans l’échantillon afin d’obtenir au moins 180 mg de MPT par filtre de 92 mm ou 100 mg de MPT par filtre de 44 mm.
   
   

2 Appareillage et équipement

1. Équipement nécessaire au conditionnement, tel qu’il est défini dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Équipement nécessaire au marquage de la longueur des mégots, tel qu’il est défini dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Équipement nécessaire au fumage des cigarettes, tel qu’il est défini dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

3 Réactifs et matériel

Nota : Lorsque c’est possible, identifier les réactifs en indiquant leur numéro de registre CAS entre crochets. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique ou supérieure.

1. Éthanol [67-17-5] à 70 % (v/v)
2. Réactifs et matériel décrits dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

4 Préparation de la verrerie

1. Nettoyer et assécher la verrerie de manière à éviter toute contamination par des résidus.
2. Stériliser toute la verrerie par autoclavage à 121 °C pendant 30 minutes à une pression de 15 livres par pouce carré (psi).

5 Échantillonnage

1. L’échantillonnage des cigarettes à des fins d'analyse doit être effectué conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

6 Préparation des cigarettes

1. Marquer la longueur des mégots de cigarettes conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Préparer les cigarettes à fumer conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Conditionner les cigarettes conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada.

7 Préparation de la machine à fumer

1. Les conditions ambiantes de fumage doivent être conformes à celles décrites dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
2. Éviter tout éclairage ultraviolet dans les pièces où des échantillons sont produits ou analysés.
3. Les conditions relatives à la machine à fumer rotative doivent être conformes à celles décrites dans la méthode officielle T-115 de Santé Canada. Noter le point suivant :
   1. Pour réduire la contamination bactérienne, nettoyer toutes les rondelles d’étanchéité en néoprène et tous les joints labyrinthe avec de l’éthanol à 70 %.
4. Pour réduire la contamination bactérienne, nettoyer les parties suivantes de la machine à fumer avec une solution d’éthanol à 70 % avant le fumage :
   1. Plaque pour cendres;
   2. Canaux;
   3. Porte-filtre;
   4. Toutes les surfaces de travail, y compris l’extérieur des fioles à extraction et des bouchons;
   5. Tout autre article (p. ex. les gants) qui pourrait entrer en contact avec l’échantillon ou les surfaces de travail nettoyées

8 Production de MPT

1. Fumer les cigarettes et recueillir la MPT conformément à la méthode officielle T-115 de Santé Canada, mais en apportant les modifications suivantes :
   • Les conditions de fumage sont modifiées de la façon suivante:
     • le volume de chaque bouffée est porté de 35 mL à 55 mL;
     • l'intervalle entre chaque bouffée est ramené de 60 s à 30 s;
     • tous les orifices de ventilation sont obturés soit par recouvrement du périmètre, de l'embout du filtre à la couture du papier de la manchette, d'une bande adhésive Mylar de marque Scotch (ruban transparent numéro 600) fermement collée, soit selon une autre méthode d'une efficacité équivalente.
   • Après le fumage du nombre requis de cigarettes, tirer trois bouffées nettoyantes et retirer le porte-filtre de la machine à fumer.
2. Mesurer la MPT conformément aux directives de la méthode officielle T-115 de Santé Canada.
3. Après avoir mesuré la MPT, retirer le filtre du porte-filtre, le plier en quatre (côté exposé à la MPT vers l’intérieur) et essuyer le porte-filtre avec le filtre plié.
4. Procéder à l’extraction de l’échantillon conformément à l’annexe 2.

Annexe 2 - Préparation de matière particulaire totale (MPT) à partir d’un disque filtrant en fibre de verre

1 Résumé

1. On extrait la MPT piégée sur un disque filtrant en fibre de verre avec du DMSO afin d’obtenir une concentration cible de 10 mg de MPT/mL de DMSO.

2 Appareillage et équipement

1. Centrifugeuse
2. Pipettes et embouts stériles (tailles variées)
3. Congélateur, -20 °C à -86 °C
4. Hotte, de classe II, type B
5. Agitateur rotatif ajusté à 200 tr/min
6. Agitateur oscillant
7. Thermomètre
8. Chronomètres
9. Étuve

3 Réactifs et matériel

Nota : Lorsque c’est possible, identifier les réactifs en indiquant leur numéro de registre CAS entre crochets. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique ou supérieure.

1. Disque filtrant en fibre de verre et porte-filtre
2. Erlenmeyer de 125 mL en polyméthylpentène (PMP), ou l’équivalent
3. Diméthylsulfoxyde (DMSO) [67-68-5]
4. Bouteilles ambrées stériles de 25 mL
5. Flacons ambrés stériles
6. Étamine stérile
7. Pipettes graduées stériles jetables (5 mL et 10 mL)
8. Tubes coniques stériles jetables en plastique (capacité de 50 mL)
9. Pinces stériles
10. Entonnoirs stériles
11. Tubes à centrifugation gradués stériles (15 mL et 50 mL)
12. Sac maillé en nylon stérile (p. ex. sacs à échantillons en tissu de Thermo Shandon)

4 Préparation de la verrerie

1. Stériliser toute la verrerie de laboratoire nécessaire par autoclavage à 121°C à une pression de 15 psi pendant le temps requis pour garantir la stérilité.

5 Préparation des échantillons

Nota 1 : Stériliser ou désinfecter l’équipement et les surfaces de travail afin de réduire au minimum la contamination naturelle durant les essais.

Nota 2 : Si le disque filtrant en fibre de verre préparé selon les directives de l’annexe 1 ne fait pas l’objet d’une extraction immédiate, on peut le conserver dans une fiole hermétiquement fermée à -70 °C ou à une température inférieure. Laisser les filtres atteindre la température ambiante avant de procéder à l’extraction au DMSO.

1. Déposer le disque filtrant en fibre de verre préparé selon les directives de l’annexe 1 dans un erlenmeyer de 125 mL en PMP stérile.
2. Pipeter la quantité requise de DMSO et la déposer dans le flacon de façon à obtenir une concentration de 10 mg de MPT/mL de DMSO. Le volume de DMSO nécessaire pour préparer une solution de MPT de 10mg/mL est déterminé par le calcul suivant :
   
   Volume (mL) = poids total de la MPT/10
   
   Nota : Le volume de DMSO à ajouter est arrondi à deux décimales.
3. Faire agiter l’erlenmeyer en PMP pendant 20 minutes à l’aide d’un agitateur oscillant.
4. Filtrer l’extrait au DMSO dans un tube à centrifugation stérile de 50 mL à travers l’étamine stérile pour enlever la matière du disque filtrant.
   
   Nota : Si la MPT a été recueillie sur un disque filtrant en fibre de verre de 44 mm, on peut également procéder comme suit pour enlever le matériel du filtre :
   
   
   • Déposer le tampon-filtre dans une bouteille ambrée de 25 mL et y ajouter une quantité adéquate de DMSO. Faire agiter le tout sur un agitateur rotatif.
   • Verser l’extrait au DMSO dans un sac maillé placé dans un tube à centrifugation conique. Centrifuger à 1 500 tr/min pendant 5 minutes.
5. Répartir l’extrait au DMSO en aliquotes dans des fioles ambrées stériles préétiquetées. Cet extrait constitue l’échantillon-mère de MPT.
6. Vérifier la stérilité de l’échantillon-mère de MPT en l’ensemençant sur une gélose nutritive qui sera incubée à 37 °C pendant 48 heures.
7. Conserver toutes les solutions à -70 °C ou à une température inférieure jusqu’au moment de leur utilisation.

Annexe 3
Exemple de rapport pour l’essai in vitro du micronoyau

1 Identification d’échantillons

Le tableau suivant présente une description des échantillons de laboratoire 30001, 30002 et 30003.

2 Données sur le fumage

Le tableau suivant présente les données sur le fumage issues des essais 2 et 3 réalisés sur le groupe 1 avec l’échantillon ID30003 au moyen d’une machine à fumer rotative.

1. Échantillons extraits dans un solvant témoin adéquat pour obtenir une concentration finale de 10,0 mg/mL.

3 Résultats du témoin positif lors de la récolte des cellules

Le tableau suivant présente les résultats du témoin positif obtenus lors de la récolte des cellules. La substance témoin positive est la mitomycine C, et les dates d’essai sont indiquées. Le temps de traitement était de 3 heures, sans activation métabolique par S9. La concentration, le nombre de cellules normales, le nombre de cellules à micronoyaux et le nombre de micronoyaux sur les lames 1 et 2 ont été notés.

4 Nombre de cellules avant le traitement

Le tableau suivant présente la numération des cellules avant le traitement pour des essais réalisés deux jours différents.

5 Données brutes sur les micronoyaux lors de la récolte des cellules
(observations par lame)

Le tableau suivant présente les données brutes sur les micronoyaux lors de la récolte des cellules. Il indique le numéro de groupe, le numéro d’essai, le code d’échantillon, la présence ou l’absence d’activation métabolique, la concentration, ainsi que le temps de traitement de chaque numération de cellules. Les résultats sont le nombre de cellules normales, le nombre de cellules à micronoyaux, le nombre de micronoyaux, et le nombre de cellules (x 105) sur les lames 1 et 2.